α-Gal抗原定量检测试剂盒（标准方法）说明书
 
使用目的：
本试剂盒适用于动物源性医疗器械、动物组织及其衍生物等相关样本中α半乳糖基抗原（α-Gal）含量的定量检测。
 
试剂盒原理：
本试剂盒完全按照行业标准《组织工程医疗器械产品 动物源性支架材料残留α-Gal抗原检测》中给出的方法，利用特异性抗-Gal抗体的酶联免疫竞争法（竞争性ELISA或者ELISA抑制法）。即：在保证抗原抗体反应物中特异性抗体过量的前提下，首先标准曲线样品及试验样品的α-Gal抗原与特异性抗体反应（消耗部分抗体）；然后用人工合成的Gal抗原（Gal-BSA）作为固相抗原，通过ELISA方法检测第一次反应后上清液中的剩余抗体；进而可利用标准曲线计算待测物中的α-Gal抗原含量。
 
试剂盒组成:
试剂盒A (2~8℃保存)                    

1	Gal抗原包被板	8孔×12条
2	裂解液	50 ml×1瓶
3	抗体Ⅰ稀释液	12ml×1瓶
4	酶标试剂	12 ml×1瓶
5	浓缩洗涤液	50 ml×1瓶
6	显色液A液	8 ml×1瓶
7	显色液B液	8 ml×1瓶
8	终止液	8 ml×1瓶
9	覆板贴膜	3张
10	说明书	1份
11	自封袋	1个

试剂盒B （-20℃保存）
 

1	苯甲基磺酰氟（PMSF）	0.9 ml×1瓶
2	Gal-BSA标准品	120μl×1瓶
3	抗体Ⅰ(特异性抗-Gal抗体)	0.6ml×1瓶

 


 
自备材料：
1.      Gal抗原阴/阳性参考品为国家标准品物质, 须自行到中国食品药品检定研究院购买。

2. 2ml或5ml离心管；
3. 移液器及吸头。

 
样本要求：
样品采集后，尽早进行样本制备并检测，若不能及时进行检测，须在-20℃保存并避免反复冻融。
 
安全性：

1. 避免接触试剂盒中的显色液A液、B液以及终止液，一旦接触需立即用大量水冲洗；
2. 试验过程中不要吸烟、饮食以及使用化妆品；
3. 不要用嘴吸试剂盒中的任何液体。

 
 
试剂盒的保存和使用注意事项:
1.       试剂盒分A和B两盒，A盒各组分需要在2~8℃保存，B盒各组分需要在-20℃保存，使用前恢复到室温并充分混合均匀；
2.       根据样品的量决定所需要的板子条数，建议样品做3个复孔，实验中不用的板条应立即放回包装袋中，并密封保存，防止受潮；
3.       未用完的试剂，应包装好，避免不同批号混用，同时避免长期打开盖子放置；
4.       试剂盒过保质期不要使用；
5.       显色液B液对光敏感，避免长期暴露于阳光下，避免用手接触，实验完成后应在规定时间内读取OD值；
6.       裂解液在使用前需要按照裂解液体积1%的量加入苯甲基磺酰氟（以下简称PMSF），现用现加，加入PMSF的裂解液要一次用完，不可存留再用；
7.       抗体Ⅰ需要使用抗体Ⅰ稀释液进行20倍稀释后使用；
8.       洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水；
9.       加入试剂的顺序应一致，以保证所有孔反应时间一样；
10.   按照说明书标示的时间以及顺序进行操作。
 
样品预处理:
1.  Gal抗原阴/阳性参考品制备：精确称取一定量的阴性/阳性参考品，置于2ml或5ml无菌离心管内，加入裂解液（裂解液在使用前需要加入1%PMSF），制成样品浓度为2mg/ml混悬液，在室温放置3h后，4000r/min、离心10min，取上清液备用。
2.  标准品制备：在阴性参考品样品中加入裂解液（裂解液在使用前需要加入1%PMSF），配制成2mg/ml作为阴性基质液，在其中加入Gal-BSA标准品，使其终浓度为 4µg/ml，之后依次用等量阴性基质液进行梯度稀释，合计7个系列浓度。
3.  检测样品的制备：精确称取试验样品（2 mg～10 mg）置于2ml或 5 ml无菌离心管内，若为固态块状或片状试验样品，则用无菌眼科剪将样品剪裁成细小碎块。加入裂解液到一定浓度（裂解液在使用前需要加入1%PMSF），浓度根据样品大致含α-Gal抗原量决定，低温匀浆2 min～10 min，至样品全部粉碎，无肉眼可见明显颗粒，形成均匀组织匀浆。室温放置3 h至样品全部裂解，4000r/min离心10min，取上清液备用。
 
样品与抗体Ⅰ反应：
将制备好的样品与抗体Ⅰ（使用抗体Ⅰ稀释液将抗体Ⅰ进行20倍稀释）等体积混合（标准品终浓度为2 µg/ml，1 µg/ml，0.5 µg/ml，0.25 µg/ml，0.125 µg/ml，0.0625 µg/ml，0.03125 µg/ml；检测样品的终浓度减半）后，在37℃轻微震荡温育2h，之后转4℃过夜。使用前在14000×g，4℃，离心30min后，取上清使用。
 
试剂盒操作过程（剩余抗体I的检测）:
1.  配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或纯化水20倍稀释。
2.  加样：分别在相应孔中加入抗体Ⅰ反应后的样品或标准品上清液各100 µl。
3.  温育：用封板膜封板后，置37℃震荡温育60分钟。
4.  洗板：小心揭掉封板膜，用排枪或其他移液器吸干样品，在每孔中注入洗液200 µl，浸泡30 s，弃去板孔中洗液，洗涤5遍，最后一次尽量扣干。
5.  加酶：每孔加入酶标试剂100 µl。
6.  温育：用封板膜封板后，置37℃震荡温育30分钟。
7.  洗板：小心揭掉封板膜，用排枪或其他移液器吸干样品，在每孔中注入洗液200 µl，浸泡30 s，弃去板孔中洗液，洗涤5遍，最后一次尽量扣干。
8.  显色：将显色液A液和显色液B液等体积混合均匀，每孔加入混合好的显色液100 µl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色30分钟。
9.  测定：取出酶标板，迅速在每孔加终止液50 µl，轻轻振荡混匀后，立即测定结果。在450 nm波长处测定各孔的OD值。
 
检测结果计算与分析:
1.  根据测定的吸光度值，计算各样品的抗体I结合抑制率。
        IR = ｛(M-b)-(T-b)｝/(M-b)×100 %
式中:
IR --抗体I结合抑制率(Inhibition rate),%；
M  --抗体I/阴性基质液反应OD值均值（100 %反应）；
T  --试验样品反应(Test sample)OD值均值（剩余抗体I的反应）；
b  --裂解液反应(blank)OD值均值。
2.  以标准品样品系列稀释浓度为横坐标（X），抗体I结合抑制率（小数）为纵坐标绘制最佳曲线方程，推荐使用对数方程，或者四参数方程软件，获得四参数方程，直接把待测样品的抗体I结合抑制率代入方程式，计算待测样品相当于标准曲线样品（Gal-BSA标准品）的量，再乘以1.82×10¹⁴/µg(Gal-BSA)，计算单位质量待测样品的Gal抗原含量。
 
试剂盒性能：
1.  灵敏度：最小的检测浓度≥标准品的第5个倍比系列稀释浓度。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为＞0.950。
2.  特异性：Gal抗原阴性生物材料参考品不会检出Gal抗原，阴性参考品的检测OD值与裂解液对照孔的反应OD值不存在显著性差异。
3.  重复性：样品检测结果的变异系数（CV）≤30%。
4.  检测回收率：标准曲线样品的检测回收率为80%～120%。
 
试剂盒局限性：
样品前处理是影响最终检测结果的重要因素，应保证抗原的充分暴露。样品中基质的干扰不可避免，为非线性的。因此，需要尽可能保证标准曲线样品的组成与待检测样品的组成相同或者相近。
 
试剂盒有效期:
试剂盒有效期为一年。