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中国药典中铜绿假单胞菌的检验及分离鉴定原理
铜绿假单胞菌为革兰氏阴性杆菌，属假单胞菌属，在自然界广泛分布，空气、土壤水、人的皮肤、呼吸道、肠道都有分布。从《中国药典》2015版1107非无菌药品微生物限度标准可以看到，除口服给药途径的制剂外，其它给药途径剂型产品均有不得检出铜绿假单胞菌的规定。那么在按照药典规定进行铜绿假单胞菌检测、分离、及传统方法鉴定的时候，您知道这些方法的原理是什么吗？
01
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基
Cetrimide Agar Medium
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 (Cetrimide Agar Medium) 是各国药典普遍收载的控制菌检查固体培养基, 用于铜绿假单胞菌的划线分离培养。首先我们看一下溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的配方和作用：
（1）营养成分：铜绿假单胞菌分解蛋白质能力较强，而发酵糖类能力较低，在培养基组分中明胶胰酶水解物和甘油为铜绿假单胞菌的生长提供碳、氮源、维生素和生长因子。
（2）无机盐：氯化镁和硫酸钾可以促进绿脓菌素的产生，并维持渗透压。
（3）选择性培养的原理：溴化十六烷基三甲铵(cetrimide)作为一种季铵盐阳离子表面活性剂，通过改变细菌细胞的通透性，使细菌发生自溶或引起菌体蛋白质变性沉淀，导致细菌死亡，有较强的抑菌作用。铜绿假单胞菌对溴化十六烷基三甲铵有一定的耐受性，因此，被用于铜绿假单胞菌的选择培养。
（4）颜色：铜绿假单胞菌生长过程中会产生两种水溶性色素：黄色的荧光素和绿色的绿脓菌素，所以在溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上菌落呈黄绿色。
02
传统生化鉴定方法
以疑似铜绿假单胞菌的溴化十六烷基三甲铵琼脂培养物或疑似菌分离纯化的TSA培养物做后续生化试验。
（1）氧化酶试验
方法：挑取可疑菌落于洁净的滤纸片上，滴加1%二盐酸N，N-二甲基对苯二胺试剂，30秒内出现粉红色并逐渐变为紫红色，为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应。
原理：铜绿假单胞菌含有细胞色素氧化酶，该酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色（如粉红色或紫红色）的醌类化合物。
（2）绿脓菌素生成试验
方法：挑取可疑菌落接种在在绿脓菌素测定用培养基（PDP）斜面上，培养24小时，观察斜面有无色素。如有色素，在试管内加氯仿3.0～5.0mL，充分震摇，使培养物中的绿脓菌素提取在氯仿中，待氯仿提取液呈现绿色时，加1mol/L盐酸约1mL，震摇后静置片刻，上层盐酸溶液中呈现粉红至红色实验结果为阳性，否则为阴性。
原理：铜绿假单胞菌能产生的绿脓菌素能被氯仿提取，且在水中溶解度比氯仿大，并且会发生可逆的氧化还原反应，氧化时碱性呈蓝色，酸性呈红色。所以加入盐酸溶液并震摇后，绿脓菌素会由氯仿转移至盐酸溶液中，并在酸性环境中呈红色。
（3）硝酸盐还原产气试验
方法：取可疑菌落接种在含小导管的硝酸盐蛋白胨水培养基内，35℃培养24小时，小导管内有气体产生实验结果为阳性，否则为阴性。
原理：铜绿假单胞菌是一类兼性好氧、以有机碳作为能源的异养硝化菌，能通过产生的酶分四步还原硝酸盐，将硝酸盐分解产生氮气。
（4）42℃生长试验
方法：以接种环沾取少许TSA培养物于0.9%无菌氯化钠溶液中，制成菌悬液。将菌悬液划线接种于TSA斜面上，置41±1℃培养培养24-48小时，斜面上如有菌苔生长为阳性反应，无菌苔生长为阴性反应。铜绿假单胞菌生长实验结果为阳性。
原理：致病性铜绿假单胞菌能在42℃条件下生长，同属的荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌都不能生长。
（5）明胶液化试验
方法：取可疑菌落穿刺接种在明胶培养基内，35℃培养24小时，取出后放2-8度冰箱10-30min，如果仍为液体，实验结果为阳性，否则为阴性。
原理：是利用铜绿假单胞菌产生胞外酶（明胶酶），使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体。
03
结果及报告
（1）供试品培养物经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者，即报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌；
（2）供试品培养物氧化酶阳性，镜检革兰氏阴性杆菌，绿脓菌素试验阴性时硝酸盐还原产气试验，42℃生长试验及明胶液化试验皆为阳性时，报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌；
（3）与（1）和（2）结果不符，报告1g或1ml供试品未检出铜绿假单胞菌。
